HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

DASAR TEORI

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantarany dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair (Acun, dkk, 2010).

Banyaknya macam-macam kromatografi yang salah satunya adalah kromatografi gas, yang merupaka metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada zaman instrumen dan elektronika. Kromatografi gas dapat dipakai untuk setiap campuran dimana semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti, suhu tekanan uap yang dipakai untuk proses pemisahan. Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen menguap dan bergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas (Acun, dkk, 2010).

Kromatografi gas metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik untuk campuran yang sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Metode ini sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan eter. Analisis minyak mentah dan atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan tehnik ini. Efisien pemisahan ditentukan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairan, dengan menggunakan fase cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa (Acun, dkk, 2010).

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample (Riyadi, 2009).

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010).

Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC adalah :

  1. a.       Reservoir pelarut : zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa tempat pelrut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut
  2. b.      Pompa : digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan kecepatan dan tekanan yang tetap
  3. c.       Injektor : saat sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat menggunakan syringe.
  4. d.      Kolom krmatografi : kolom yang dipakai memiliki panjang 10 – 25 cm dan diameter 4,5 – 5 mm yang diisi dengan fase stasioner beukuran 5-10 mikrometer dan terbuat dari logam atau stainlessteel.
  5. e.       Detektor : digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk mempunyai sinsitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi.

Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Cupritabu, 2010).

Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. Prinsip umum kromatografi:

Keterangan :

  1. Fase gerak
  2. Fase diam
  3. Kolom
  4. Detektor
  5. Rekorder

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Cupritabu, 2010).

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya mnyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik (Cupritabu, 2010).

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Tabel 1. Metode Regresi Linier Tinggi Puncak

No

Konsentrasi (x)

Tinggi Puncak (y)

x2

xy

1

2

3

4

5

10 ppm

20 ppm

30 ppm

40 ppm

50 ppm

650720

1169327

1641152

2147374

2598370

100

400

900

1600

2500

6507200

23386540

49234560

85894960

129918500

30

1641388,6

1100

58988352

Tabel 2. Metode Regresi Linier Luas Puncak

No

Konsentrasi (x)

Tinggi Puncak (y)

x2

xy

1

2

3

4

5

10 ppm

20 ppm

30 ppm

40 ppm

50 ppm

9791576

17844718

25496981

33785045

40718306

100

400

900

1600

2500

97915760

356894360

764909430

1351401800

2035915300

30

40134014

1100

921407330

Tabel 3. Pengukuran Cuplikan Parasetamol

Senyawa

Tinggi puncak

Luas puncak

Waktu retensi

Cuplikan

2770892

43993152

2 menit

4.2 Pembahasan

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. HPLC (high performance liquid chromatography) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. Zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Komponen utama HPLC adalah : reservoir pelarut, pompa, injektor, kolom kromatografi, detektor. Dalam HPLC, fasa diam adalah fasa yang secara tetap tidak bergerak, biasanya berbentuk partikel dan terletak di dalam tabung kolom. Fasa gerak adalah fasa yang bergerak dengan arah yang telah ditentukan. Pada percobaan yang digunakan sebagai fasa gerak adalah metanol dan sampel adalah paraseamol.

Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak maksimum pada grafik dari senyawa itu.

Cara kerja HPLC adalah sampel yang larut dalam fase gerak diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi dengan menggunakan syringe. Volume yang ditampung adalah 0,2 ml, juk berlebih akan dikeluarkan. Fase gerak akan dialirkan dengan menggunakan pompa. Sampel yang masuk dalam kolom akan didorong oleh fase gerak sehingga zat-zat yang terkandung dalam sampel akan dianalisis dan bereaksi dengan fase diam. Oleh detektor akan dibaca dan dihasilkan keluaran berupa grafik dan data tinggi beserta luas puncak dalam bentuk angka.

Gambar 1. Skema komponen instrument HPLC        Gambar 2. Alat HPLC

Keterangan skema :

1. Solvent reservoirs

2. Solvent degasser

3. Gradient valve

4. Mixing vessel

5. Pompa bertekanan tinggi

6. Switching valve dalam”inject position” dan 6’. Switching valve dalam “load position”

7. Sample injection loop

8. Pre-column

9. Analytical column

10. Detektor

11. Data acquisition

12. Waste or fraction collector

Pada percobaan ini, parasetamol yang terkandung dalam sampel apabila dianalisis dengan HPLC, memiliki waktu retensi sekitar 2 menit. Sampel yang mengandung parasetamol paling banyak memiliki tinggi dan luas puncak yang lebih besar. Dapat dilihat pada tabel 1 dan 2, semakin besar konsentrasi parasetamol, maka tinggi dan luas puncak semakin besar.

Berdasarkan larutan cuplikan yang memiliki waktu retensi 2 menit dengan tinggi puncak 2770892 dan luas puncak 43993152. Berdasarkan perhitungan, konsentrasi yang diperoleh pada tinggi puncak adalah 51,73 ppm sedangkan pada grafik   ppm. Perhitungan konsentrasi luas puncak adalah 52,56 ppm sedangkan pada grafik   ppm. Hal ini dapat disebabkan karena kurang akurat dalam pembuatan kurva karena angka tinggi dan luas puncak terlalu besar.

DAFTAR PUSTAKA

 Acun., Sodiyc. 2010. Kromatografi Gas. http://sodiycxacun.blogspot.com. 11 November 2010.
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit Andi Offset. Yogyakarta.
Cupritabu, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat dengan HPLC. http://cuprittrappedonlab.blogspot.com. 11 November 2010.
Khopkar, S.M., 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.
Riyadi, W. 2009. Identifikasi signal kromatogram HPLC. http://wahyuriyadi.blogspot.com. 11 November 2010.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s