Bakteri mudah ditemukan di air, udara dan tanah. Mereka hidup dalam suatu koloni, baik bersimbiose, bebas ataupun parasit pada makhluk hidup. Jumlah bakteri di alam sangat melimpah dengan keragaman yang sangat tinggi. Untuk mempelajari kehidupan dan keragaman bakteri, diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan mereka dalam skala laboratorium. Pengembangbiakan ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat, seperti tanah, udara, sisa makanan, dan lain-lain, dalam media yang mengandung nutrisi. Media pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur, media diferensial, dll. Masing-masing media memiliki fungsi berbeda dan digunakan tergantung tujuan dari praktikan. Dalam mempelajari sifat pertumbuhan dari masing-masing jenis mikroorganisme, maka mikroorganisme tersebut harus dipisahkan satu dengan yang lainnya, sehingga didapatkan kultur murni yang disebut isolat. Kultur murni merupakan suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu species atau satu galur mikroorganisme. Kultur murni diperoleh dengan cara isolasi menggunakan metode tuang maupun gores (Pelczar dan Chan, 1986).

Isolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono, 1980). Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam medium yang baru diperlukan ketelitian dan pengsterilan alat-alat yang digunakan, supaya dapat dihindari terjadinya kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru, maka cawan petri tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya tetesan air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri (Dwijoseputro, 1987).

Mikrobia yang hidup di alam terdapat sebagai populasi campuran dari bebagai jenis mikrobia yang berbeda prinsip dari isolasi mikrobia dalam memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya dari lingkungannya dialam dan ditumbuhkan dalam medium buatan. Pertumbuhan mikroba dapat dilakukan dalam medium padat, karena dalam medium padat sel-sel mikroba akan terbentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutejo dkk, 1991).

Menurut Pradhika (2008), ada beberapa teknik isolasi mikrobia, yaitu :

  1. Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

  1. Spread plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar, agar diperoleh kultur murni. Prosedur kerjanya adalah suspensi cairan diambil sebanyak 0,1 ml dengan mikropipet kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Trigalski kemudian dibakar diatas bunsen dan didinginkan beberapa detik. Kemudian suspensi diratakan dengan menggosokannya pada permukaan agar , penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

            

  1. Pour plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat dan dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri dan dihomogenkan lalu dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya terdapat pada permukaan agar saja tapi juga di dalam atau dasar agar sehingga bisa diketahui sel yang dapat tumbuh dipermukaan agar yang kaya Odan di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung O2. Prosedur kerjanya adalah petridish, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair disiapkan. Kemudian 1 ml suspensi bakteri diteteskan secara aseptis ke dalam cawan kosong· Lalu medium yang masih cair dituang ke dalam petridish lalu petridish di putar membentuk angka 8 agar suspensi bakteri dan media homogen, kemudian diinkubasi.

  

Pada spread plate diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml dan pada pour plate diteteskan sebanyak 1 ml karena spread plate bertujuan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

 

  1. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

  1. Goresan Sinambung

Prosedur kerjanya adalah inokulum loop (ose) disentuhkan pada koloni bakteri dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Lalu petridish diputar 180o dan dilanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

  1. Goresan T

Prosedur kerjanya adalah petridish dibagi menjadi 3 bagian menggunakan spidol dan daerah tersebut diinokulasi dengan streak zig-zag. Ose dipanaskan dan didinginkan, lalu distreak zig-zag pada daerah berikutnya.

  1. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

 

Menurut Pradhika (2008), untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan dapat dilakukan pengenceran. Dengan pengenceran, koloni akan lebih mudah diamati. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.

 

 

Menurut Jutono (1980), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi bakteri, yaitu :

  1. Sifat-sifat spesies mikrobia yang akan diisolasi
  2. Tempat hidup atau asal mikrobia tersebut
  3. Medium untuk pertumbuhannya yang sesuai
  4. Cara menanam mikrobia tersebut
  5. Cara inkubasi mikrobia tersebut
  6. Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksud
  7. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni

 

Medium agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme. Teknik yang digunakan memungkinkan bakteri tumbuh pada jarak yang berjauhan dari sesamanya dan membentuk koloni. Semua sel dalam koloni dianggap sebagai turunan atau progeni suatu mikroorganisme yang disebut dengan biakan murni. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Dengan menginokulasikan medium agar nutrien dengan metode yang benar, maka sel-sel bakteri akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah diinkubasi, bakteri akan memperbanyak diri dengan cepat selama 18-24 jam, sehingga terbentuk massa sel (koloni) yang dapat terlihat dengan mata telanjang (Pelczar dan Chan, 1986).

Untuk memastikan mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimakudkan maka diperlukan pengujian. Uji yang bisa digunakan adalah dengan cara pengecatan gram. Apabila bakteri tidak berubah maka bakteri yang diisolasi sudah merupakan biakan murni dan bila di dalam uji pengecatan gram berubah bakteri gramnya maka isolasi tidak berhail karena belum berubah menjadi biakan murni. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya kontaminan di dalam isolasi bakteri ( Volk dan Wheeler, 1993).

Pada saat isolasi, mikroba perlu dilakukan inokulasi mikroba. Sebelum dan sesudah menginokulasikan mikroba jarum ose yang digunakan harus dipanaskan terlebih dahulu. Hal ini bertujuan agar jarum ose yang digunakan bersifat steril dan bebas kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sedangkan pada cawan petri, setelah sampel dimasukan ke dalam cawan petri setiap membuka dan menutup cawan petri harus terlebih dahulu dipanaskan untuk meminimalkan terkontaminasinya sampel. Wadah media yang menggunakan cawan petri, pada saat inkubasi mikroba pada cawan petri selalu dalam posisi terbalik. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah mikroba terkena uap air yang dihasilkan pada saat inkubasi, sehingga kualitas mikroba tidak rusak atau mengalami gangguan.

Ada beberapa metode yang digunakan dalam isolasi bakteri, yaitu :

  1. Metode pour plate

Metode ini dilakukan dengan menginokulasikan suspensi bahan yang mengandung bakteri dengan bantuan mikropipet untuk disemprotkan ke dalam medium agar yang sedang mencair dan menuangkannya pada petridish. Pada metode ini, volume suspensi yang digunakan lebih dari 0,1 ml, biasanya 1 ml. Suspensi bakteri tersebut diambil dengan mikropipet dan disemprotkan ke dalam petridish yang berisi medium. Setelah diinkubasi akan terlihat koloni bakteri yang bermacam-macam, kemudian satu koloni dipilih dan diambil dengan ose, kemudian dilanjutkan dengan pengecatan gram.

  1. Metode streak plate

Streak plate yaitu suatu cara pengisolasian bakteri yang cara inokulasinya dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium dengan kawat ose dan digoreskan sesuai dengan petridish. Kultur media untuk menumbuhkan atau mengisolasikan bakteri dengan metode streak merupakan suatu teknik untuk memisahkan sel bakteri secara individual. Setelah inkubasi, maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri.

  1. Metode spread plate

Spread plate adalah metode isolasi bakteri dengan cara menginokulasikan suspensi bahan yang mengandung bakteri ke atas medium agar lalu diratakan dengan menggunakan trigalski. Setelah diinokulasikan akan terlihat koloni-koloni bakteri yang tumbuh tersebar dipermukaan medium agar sehingga dapat diisolasi lebih lanjut untuk mendapatkan biakan murni.

Isolasi / metode

Gambar

Parameter

Hasil pengamatan

Bakteri tanah

Jumlah koloni

5

Bentuk koloni

Circulair

Tepian

Lobate

Elevasi

Convex

Pour 10-3

Jumlah koloni

4

Bentuk koloni

Circulair, irregulair, rhizoid, curled

Warna

Krem, kuning

Pertumbuhan

Permukaan

Tepian

Cremate

Elevasi

Convex regose, effuse, umbonate

Streak 10-3

Jumlah koloni

13

Bentuk koloni

Circulair, curled, myceloid

Warna

Krem, putih transparan

Pertumbuhan

Permukaan

Tepian

Erose, entire, undulate

Elevasi

Convex, raised, raise with concave bavelend edge

Spread 10-4

Jumlah koloni

6

Bentuk koloni

Rhizoid, circulair

Warna

Krem

Pertumbuhan

Permukaan

Pada percobaan ini, digunakan bakteri udara dengan pengenceran 10-3 dan 10-4. Bakteri ini diisolasi dengan metode pour plate, streak plate dan spread plate. Metode pour plate memerlukan agar yang belum padat dan dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri dan dihomogenkan lalu dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya terdapat pada permukaan agar saja tapi juga di dalam atau dasar agar sehingga bisa diketahui sel yang dapat tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung O2. Setelah diinkubasi selama 48 jam di suhu 37oC, untuk bakteri tanah pengenceran 10-3, diperoleh jumlah koloni sebanyak 4 koloni yang berbentuk circulair, irregulair, rhizoid, dan curled dengan warna koloninya krem dan kuning. Pertumbuhan bakteri ini pada permukaan medium. Tepiannya berbeentuk cremate, ciliate, dan fimbriate, sedangkan elevasinya convex, regose, effuse, dan umbonate. Setelah dilakukan pengecatan gram, diperoleh koloni dengan bentuk bulat dan batang panjang serta ada yang berwarna ungu yang menunjukkan gram positif dan berwarna merah yang menunjukkan bakteri ini juga termasuk gram negatif. Kelebihan metode pour plate ini adalah mudah diamati, tidak ada persaingan antarbakteri untuk mengambil O2 karena letaknya tersebar, koloninya terpisah. Kekurangan bakteri ini adalah boros waktu dan bahan, mudah  terkontaminasi.

Metode streak plate dilakukan dengan cara menggoreskan biakan pada ose ke medium agar pada petridish. Penggoresan dilakukan dengan goresan kuadran (dibagi empat). Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisme. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Setelah dilakukan inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC, bakteri udara pengenceran 10-3, diperoleh jumlah koloni 13 koloni dengan bentuk koloninya circulair, curled, dan myceloid yang berwarna krem dan putih transparan. Pertumbuhan koloninya pada permukaan medium. Tepian koloni yang terlihat berbentuk erose, entire, dan undulate dengan elevasinya berbentuk convex, raised, dan raised with concave bavelend edge. Pada koloni ini dilakukan pengecatan gram dan diperoleh koloni yang berbentuk bulat dan batang pendek serta berwarna ungu yang menunjukkan gram positif. Kelebihan metode goresan adalah menghemat waktu dan bahan, serta dapat menghasilkan bakteri yang diinginkan jika isolasi bakteri dilakukan dengan tepat dan teliti. Kekurangan metode ini adalah diperlukan keterampilan yang khusus untuk mendapatkan koloni yang terpisah.

Metode spread plate yaitu teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar, agar diperoleh kultur murni. Suspensi cairan diambil sebanyak 0,1 ml dengan mikropipet kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Trigalski kemudian dibakar diatas bunsen dan didinginkan beberapa detik. Kemudian suspensi diratakan dengan menggosokannya pada permukaan agar. Setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC, bakteri udara pengenceran 10-4, diperoleh jumlah koloni sebanyak 4 koloni yang berbentuk rhizoid dan circulair, berwarna krem serta pertumbuhannya pada permukaan medium. Pada koloni ini tidak dilakukan pengamatan dengan pengecatan gram. Kelebihan metode ini adalah diperoleh koloni bakteri yang terpisah, labih mudah dilakukan dan membutuhkan medium yang sedikit. Kekurangannya adalah waktu yang digunakan lebih lama dan mudah terkontaminasi.

Pada bakteri udara dengan metode terbuka, yaitu petridish yang sudah berisi medium agar padat dibiarkan terbuka selama 5-10 menit kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam dan diperoleh jumlah koloni sebanyak 4 koloni yang bentuk koloninya adalah circulair, tepiannya berbentuk lobate, dan elevasinya berbentuk convex. Setelah dilakukan pengecatan gram, diperoleh koloni yang berbentuk bulat serta berwarna ungu yang menunjukkan gram positif dan juga berwarna merah yang menunjukkan gram negatif.

Kelebihan dari pengisolasian bakteri udara adalah tidak membutuhkan keahlian tinggi dan sederhana karena hanya membiarkan medium pada udara terbuka sekitar 5-10 menit. Kekurangannya adalah membutuhkan waktu yang lama dan tidak mendapatkan bakteri yang bersifat anaerob. Tujuan pemindahan bakteri dari petridish ke medium agar miring untuk menunjukkan tingkatan keberhasilan dari suatu pengisolasian. Dengan mengidentifikasi dan membandingkan sama tidaknya bakteri yang tumbuh pada petridish dan medium agar miring, maka dapat dilihat tingkat keberhasilan dalam mengisolasikan bakteri tersebut. Jika hasil yang diperoleh sama, artinya pengisolasian bakteri berhasil dan diperoleh biakkan murni. Sebaliknya jika hasil yang diperoleh tidak sama, artinya pengisolasian kurang atau tidak berhasil.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1987. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang.
Jutono, J. 1980. Pedoman Praktikum Mikroiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi. Penerbit Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Gajah Mada. Yogyakarta.
Pelczar. M.J., dan Chan, E. S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.
Pradhika, E. I. 2008. Isolasi Mikroorganisme. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-4-isolasi-mikroorganisme.html/ 5 Maret 2011.
Sutejo, M. M., Kartasaputra., Sastroadmodjo. 1991. Mikrobiologi Dasar. Reika Cipta. Jakarta.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Jilid 1, Edisi kelima. Erlangga. Jakarta.

About these ads